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    如何解決酶切切過頭的問題?

    發(fā)布時間: 2021-08-25  點擊次數(shù): 11901次

    之前談到了酶切切不動的問題。這一次,我們探討一下酶切的另外一端:酶切切過頭的問題。還是按照一貫的做法和思路,發(fā)現(xiàn)主要是兩個原因?qū)е碌模鉀Q辦法也是有的。


    一、酶切時間過長 

    酶切時間過長的確有時候會對目的條帶有影響,因為你用的酶可能會有星號活性。那么什么叫星號活性呢?通俗一點講,就是酶不去切它該切的地方,瞎切一氣......酶切時間過長,會導(dǎo)致最后亂切。安培建議:雙酶切不要超過 5 小時。其實一般 3-4 小時足夠了。你應(yīng)該有提供給你酶的生物試劑公司的相應(yīng)的說明書的吧?上面都有寫明酶的活性和作用時間?,F(xiàn)在的酶都很不錯的,10 到 15 分鐘就可以都切完。一般只水浴一個小時,不會再長了。 如果時間太長,就會造成下圖所示的情況。注意第四泳道紅框標注的地方。居然切出了 5 根 條帶。這顯然是時間過長了。


    二、酶量過多 

    和過長的反應(yīng)時間會造成非特異性的酶切(星號活性)一樣,酶加多了也會產(chǎn)生星號活性。一般來說,所加酶的體積不能超過酶切總體積的 1/10,否則甘油濃度會超過 5%,會產(chǎn)生星號活力。在使用高酶量的時候需要注意甘油的最終濃度不要超過 5%,也就是說 10ul 的體系, 酶的用量不要超過 1ul。

    以 TAKARA 的酶為例,其對 1 單位酶的定義如下:在 50 μl 反應(yīng)液中,30℃溫度下反應(yīng) 1 小 時,將 1 μg 的 λDNA *分解的酶量定義為 1 個活性單位(U)。 而該酶濃度約為 15 U/μl。 在除外酶降解的因素外,理論上,該酶可分解 15μg 的 DNA。而一般從 1-4ml 菌液提出的 DNA 約為 3μg,而 PCR 純化后的產(chǎn)物(50 體系)約為 3μg,所以即便全部加進去,只要純化的質(zhì)量非常好,酶切也*切得動。注意,不要加多了呀。

    但是給推薦的一般都是 20 ul 體系加 1ul。 其實,在 20ul 只加 0.5ul 酶,切的效果也很好。

    其實,除了考慮酶濃度(每 ul 多少個單位)以外,還應(yīng)該考慮這種酶在 λ DNA 上的酶切位點數(shù)目。比如用 Hinc Ⅱ和 XbaI 雙切 pUC118,這兩個酶在 pUC118 上都只有一個酶切位點, 而在 λDNA 上的酶切位點分別是 35 個和 1 個。根據(jù)酶活性的定義,相同單位的 Hinc Ⅱ和 XbaI 對 pUC118 的酶切效率是 35 比 1,所以在雙酶切體系中,所用的 Hinc Ⅱ顯然應(yīng)該要少很多。舉這個例子,是想說明:大家再考慮酶濃度的時候,應(yīng)該多想一層。


    綜上所述,酶切切過頭了的原因,其實并沒有酶切切不動那么復(fù)雜。不外乎時間過長和酶量太大。童鞋們只要注意一些,一般都沒有問題。

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