DNA 測(cè)序技術(shù)自從發(fā)明以來(lái)，作為一種重要的分子生物學(xué)手段，正在科研和臨床上得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。下面，介紹一下DNA測(cè)序里的大坑。給大家一個(gè)前車之鑒吧。

坑一：信號(hào)衰減/中斷

測(cè)序信號(hào)衰減和中斷，是測(cè)序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題，原因多種多樣：模板中含有重復(fù)序列，模板中含有高級(jí)結(jié)構(gòu)，模板中 GC 含量過(guò)高等，都會(huì)使得測(cè)序信號(hào)衰減和中斷。另外，引物的質(zhì)量不好，試劑失活了，都會(huì)造成這種問(wèn)題。解決的方法：反其道而行之，采用反向引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序，然后通過(guò)序列拼接獲得全長(zhǎng)。有時(shí)候就象做拼圖游戲。大家 have fun 吧。這里，教大家一個(gè)小竅門：在這個(gè)過(guò)程中，可以適量地加入 DMSO，并且進(jìn)行擴(kuò)增。

坑二：重疊峰/亂峰

這個(gè)問(wèn)題一般是由于序列前面有連續(xù)的堿基，或者是引物的堿基缺失了。如下圖所示，模板中有單一位點(diǎn)的堿基缺失，堿基缺失導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果移碼。

現(xiàn)在有很多測(cè)序公司，號(hào)稱可以幫助設(shè)計(jì)引物；號(hào)稱引物是 PAGE 級(jí)別的。這里，嚴(yán)重不推薦哈。最好還是自己動(dòng)手，豐衣足食。解決辦法：自己設(shè)計(jì)引物；自己合成引物；自己將引物進(jìn)行 PAGE 純化。反正就是掌握一個(gè)原則：自己動(dòng)手，豐衣足食。

坑三：Ploy 結(jié)構(gòu)

有的時(shí)候，我們會(huì)遇到 Poly 結(jié)構(gòu)，就是 G/C rich，G/C Cluster，Poly A，Poly T 結(jié)構(gòu)等。這種結(jié)構(gòu)的測(cè)序容易出現(xiàn)移碼現(xiàn)象，導(dǎo)致測(cè)序信號(hào)衰減和中斷（如下圖）。解決方法：還是反其道而行之。采用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該 poly 結(jié)構(gòu)處，進(jìn)行拼接，不就可以獲得序列全長(zhǎng)嘛。

坑四：空載體

原因?yàn)椋耗康钠尾迦胧。蛘吲囵B(yǎng)過(guò)程中目的片段丟失。解決方案：重起爐灶。重新挑選單克隆，進(jìn)行 PCR 后，再送去測(cè)序。

坑五：測(cè)序結(jié)果和文獻(xiàn)資料不一樣

這個(gè)會(huì)以為是實(shí)驗(yàn)?zāi)睦锍鰡?wèn)題了，或者是測(cè)序公司那里出問(wèn)題了。這個(gè)問(wèn)題是沒(méi)有辦法滴。同一種動(dòng)物，不同的種族，甚至不同的個(gè)體，基因序列都不一定*一樣。如果是 PCR 產(chǎn)物克隆測(cè)序，那還有 PCR 過(guò)程中的錯(cuò)配因素等等。

一般比較正規(guī)的測(cè)序公司，提供的測(cè)序結(jié)果都是忠實(shí)結(jié)果，和文獻(xiàn)序列不一樣，也就只好不一樣啦。

坑六：重復(fù)序列

如下圖所示，好看吧？好看是好看，但是真的看到這個(gè)結(jié)果，可能就要哭鼻子了。可能的原因：樣品中就含有重復(fù)序列，結(jié)果導(dǎo)致：測(cè)序結(jié)果和 Poly A/T 的結(jié)果一樣。這也會(huì)導(dǎo)致 Frame 滑動(dòng)，結(jié)果出現(xiàn)移碼。

解決辦法: 還是反其道而行之，反向測(cè)序。有時(shí)能夠順利的通過(guò)重復(fù)序列區(qū)域，但是有時(shí)候又不一定能夠。全靠運(yùn)氣吧。如果能夠的話，通過(guò)多次的測(cè)序結(jié)果比對(duì)，還是做拼圖游戲吧，拼接可以得到全序列結(jié)果。