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    原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率受何因素影響?

    發(fā)布時(shí)間: 2022-01-05  點(diǎn)擊次數(shù): 1077次
       細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA、RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)染技術(shù)已成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中,其應(yīng)用越來越廣泛。原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑可轉(zhuǎn)染極度難轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞、懸浮細(xì)胞,如T細(xì)胞、NK細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、THP-1等;可高效率轉(zhuǎn)染siRNA到任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞。用于將DNA和siRNA轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞系和各種原代細(xì)胞中;轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可10小時(shí)內(nèi)快速代謝的第三代新轉(zhuǎn)染試劑。
      原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率受以下因素影響:
      1.細(xì)胞培養(yǎng)物
      健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基,血清和添加物。低的細(xì)胞代數(shù)能確?;蛐筒蛔?。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度,一般的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)有專門的說明。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞,這將提供正常細(xì)胞代謝,增加對(duì)外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌,支原體或真菌的污染。
      2.血清
      大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。胎牛血清經(jīng)常用到,便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。通常的,血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物,對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。因此在轉(zhuǎn)染前建議先測(cè)(轉(zhuǎn)右)試出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好的血清批號(hào),轉(zhuǎn)染時(shí)用同一批號(hào)的血清,并同時(shí)做負(fù)對(duì)照以測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低,因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷,甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。
      3.載體構(gòu)建
      轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高,但不同病毒載體有其特定的宿主,有的還要求特定的細(xì)胞周期,如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞,此外還需考慮一些安全問題。除載體構(gòu)建外,載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響,如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用,轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行,因此選擇組成或可調(diào)控,強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要,同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。
      4.DNA質(zhì)量
      DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子、蛋白、代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。
      5.轉(zhuǎn)染技術(shù)
      轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大,許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例,細(xì)胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。
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