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    分離培養(yǎng)細胞

    發(fā)布時間: 2022-12-02  點擊次數(shù): 1123次

    原理


    骨豁肌源性成肌細胞能夠培養(yǎng)從幾種成年動物骨骼肌分離的成肌細胞。在培養(yǎng)條件下,成肌細胞仍繼續(xù)表達一些分化特征。成肌細胞稱衛(wèi)星細胞,分化早期的步驟與骨骼肌很相似。成肌細胞在培養(yǎng)底物上增殖和遷移,然后成直線排列,最終融合形成多細胞核肌管。在單肌纖維培養(yǎng),按整塊取骨骼肌。用膠原蛋白液孵育,以消化結締組織。然后,輕微機械性研磨使肌纖維分離??蓮墓趋兰》蛛x出肌纖維及其衛(wèi)星細胞。在添加 20%(fetal bovine serum, FBS) 的 Ham's F12 培養(yǎng)中,原代細胞容易生長。在不改變培養(yǎng)條件的情況下,這些細胞增殖和分化,融合形成多個細胞核的肌管。這證明培養(yǎng)的細胞具有成肌性


    材料與儀器

    活檢組織塊
    Ham F12 FBS D-PBSA
    手術刀 長剪刀 Petri 培養(yǎng)皿 離心管 血細胞計數(shù)板

    步驟


    一、材料


    無菌


    1. 轉運培養(yǎng)液:Ham F12(Seromed 08101),不含 NaHCO3,含有 20 mmol/LHEPES(Serva 25245),75 ml


    2. 生長培養(yǎng)液: Ham F12, 添加 20%FBS(Gibco 011-06290),200 ml


    3. 鏈霉菌蛋白酶液:0.15% 鏈霉菌蛋白酶(Sigma P-6911)、0.03% EDTA(Merck 8418)、20IU/ml 青霉素和 20ug/ml 鏈霉素(0.4%Eurobio PES300),用 Ham F12 或 D-PBSA 配制 100 ml


    4. D-PBSA:100 ml


    5. 尼龍網:孔徑為 100um


    6. 手術刀


    7. 鋒利的長剪刀


    8. Petri 培養(yǎng)皿:直徑為 90 mm,用于切組織塊


    9. 培養(yǎng)皿:25 cm2,4 個


    10. 20 ml 離心管或一般容器,5 只


    非滅菌


    1. 血細胞計數(shù)板


    二、操作步驟:


    1. 分離:用手術刀切除活檢組織塊上的非肌性組織,然后用 D-PBSA 浸洗。


    2. 稱重前,與肌纖維平行將切除活檢組織切成片,用 D-PBSA 沖洗。


    3. 將組織片平行放入 Petri 培養(yǎng)皿蓋內,切成較薄的柱狀組織塊,然后切成 1 mm3小塊。不要擠壓組織。也可在試管內用長剪刀將組織簡稱小塊,應避免擠壓組織。


    4. 用 D-PBSA 浸洗組織塊,靜置后吸取上清液。


    5. 在 37℃ 條件下,用鏈霉菌蛋白酶液消化組織塊 1 h。每 1~3 mg 組織塊用 15 ml 鏈霉菌蛋白酶液。每間隔 10~15 min 輕輕搖晃試管。


    6. 孵育后用吸管研磨組織塊。由于越來越多的細胞分離下來,培養(yǎng)液會逐漸變得渾濁。


    7. 讓組織塊沉到試管的底部,形成沉降的組織塊(P1)和上清液(S1)。


    8. 用孔徑為 100um 的尼龍網將 S1 濾入 20 ml 離心管。輕輕搖晃或用吸管吹打上清液,使細胞混懸。


    9. 離心(350 g,8~10 min)后,吸取上清液。


    10. 準確加入 10 ml 生長培養(yǎng)液,用帶有橡皮吸頭的吸管很輕微地混懸細胞。然后,用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞。


    11. 用生長培養(yǎng)液稀釋細胞懸液,以約 1.5x104個/ml 的細胞密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶。從 1 g 健康供體活檢組織約獲得 1~2x105 個細胞。


    12. 將 15 ml 消化液加入 P1,在 37℃ 水浴中孵育組織塊 30 min,并定時搖晃。


    13. 用吸管吹打細胞懸液,使細胞分散。然后,用尼龍網過濾細胞懸液。用 20 ml 生長培養(yǎng)液浸洗濾網。


    14. 離心(350 g,8~10 min)后,計數(shù)細胞,按上述方法接種細胞。


    15. 將培養(yǎng)瓶移入濕潤的培養(yǎng)箱,在 37℃ 和 5%CO2 的條件下培養(yǎng)細胞,


    安全提示
    在扔入垃圾前,應該用次氯酸鹽處理剩余組織和使用過的試管、吸管、培養(yǎng)皿。


    維持培養(yǎng)


    16. 接種后 24 h 很輕微地換培養(yǎng)液,以后每 3~4d 換液 1 次。細胞主要向著分化生長。人成肌細胞的生長分 3 期,培養(yǎng)后 4~6d 增殖達高峰;8d 作用排列成 行;10~12d 細胞融合形成肌管增多。然而,必須記住一些細胞可能分化較早,絕大多數(shù)細胞分化時一些細胞仍處于增殖狀態(tài)。


    傳代培養(yǎng)


    17. 將少量 EDTA 輕輕注在細胞上面后立即吸取。


    18. 加入 0.25% 胰蛋白酶液,足以在細胞上面形成一薄層。


    19. 當細胞去附著時,加入 5~10 ml 完-全生長培養(yǎng)液,用吸管很輕微地吹打細胞,然后離心(350 g,10 min)。


    20. 計數(shù)細胞,按一定密度種植細胞。


    注意事項


    在扔入垃圾前,應該用次氯酸鹽處理剩余組織和使用過的試管、吸管、培養(yǎng)皿。培養(yǎng)液需要在無菌的環(huán)境下才能打開,避免污染。


    常見問題


    1. 成肌細胞稱衛(wèi)星細胞,分化早期的步驟與骨骼肌很相似。成肌細胞在培養(yǎng)底物上增殖和遷移,然后成直線排列,最終融合形成多細胞核肌管。盡管用胰蛋白酶消化法可將成肌細胞傳代培養(yǎng)3 ? 4 代,但一旦分化(融合)即不能傳代培養(yǎng)。

    2. 成肌細胞特點:易于獲取,來源廣泛,易于分離且體外培養(yǎng)增殖快,并在培養(yǎng)階段易于接受外源基因。


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