背景介紹

Caco2細胞是常見的結(jié)腸腺癌細胞，正常情況下，Caco2細胞在培養(yǎng)的過程中貼壁生長，其形態(tài)多為多邊形或梭形，增殖速度較快，其鏡下形態(tài)如下圖所示，密度已大于90%，可以進行傳代。

圖：Caco2細胞形態(tài)

培養(yǎng)方法

1.培養(yǎng)基配置：DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素雙抗+1%谷氨酰氨。

2.其余需要準備的試劑耗材包括：無菌PBS、胰酶、無菌槍頭、細胞培養(yǎng)皿、15ml離心管、離心機、生物安全柜、水浴鍋、75%酒精。

3.培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。

4.細胞復(fù)蘇：提前將水浴鍋溫度調(diào)至37℃，從液氮罐中拿出細胞，迅速放在37℃水浴鍋中輕輕晃動，使細胞快速融化，融化后用移液器輕輕混勻，將其轉(zhuǎn)移到15ml離心管內(nèi)，加入1-2ml培養(yǎng)基，室溫800rpm離心5min，去上清后加入1ml培養(yǎng)基重懸10次左右，將其全部加入6cm細胞培養(yǎng)皿內(nèi)（提前加入4-6ml培養(yǎng)基），十字混勻后放入細胞培養(yǎng)箱中，24h觀察細胞密度進行后續(xù)操作。

5.細胞傳代：當(dāng)細胞密度≥90%時，進行細胞傳代，吸掉原有培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)皿邊緣加入1ml PBS清洗，吸掉PBS后加入750μl含EDTA的胰酶消化，消化時間2min左右，消化完成后加入1.5ml培養(yǎng)基中止消化，用移液槍吹打，保證細胞全部被吹下，將混合液全部轉(zhuǎn)移到離心管中，室溫800rpm離心5min，去上清后加入1ml培養(yǎng)基充分重懸，取333μl加入有4ml培養(yǎng)基的6cm細胞培養(yǎng)皿中，十字混勻后放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，1-3天后根據(jù)細胞密度換液或傳代。

6.細胞凍存：如前述收集細胞沉淀，加入1ml凍存液（培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7：2：1）充分重懸，將混合液移入凍存管內(nèi)，標記好基本信息，將凍存管入凍存盒后放入-80℃冰箱，24h后可將凍存管放入-80℃冰箱細胞盒內(nèi)。

一些心得

1.細胞新復(fù)蘇后，一般24h進行補液2ml，48h后再進行傳代處理。對于新復(fù)蘇的細胞由于比較脆弱，一般第一次傳代比例為1：2。

2.Caco2細胞增殖較快，上述提到的333μl是按常規(guī)1：3的比例進行傳代，最大比例應(yīng)不超過1：7。就我個人來說，1：3傳代2天即可長滿，僅作為參考。

3.對于新復(fù)蘇的細胞，若要凍存，最少應(yīng)該傳一代再進行凍存。同樣如果要進行細胞轉(zhuǎn)染等對細胞有較大傷害的操作時，最少應(yīng)該傳兩代，保證細胞質(zhì)量良好的情況下進行。

4.細胞培養(yǎng)全程應(yīng)注意無菌操作，用到的試劑耗材均使用75%酒精消毒，同時也要對手部進行消毒。

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