蛋白免疫檢測技術(shù)是基于抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，用于檢測生物樣品中蛋白質(zhì)的存在、含量、分布及相互作用的一類分析技術(shù)。這類技術(shù)具有高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、生物學(xué)研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域。以下是幾種常見的蛋白免疫檢測技術(shù)及其原理、應(yīng)用和特點(diǎn)：

一、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

原理

將抗原或抗體固定在固相載體（如微孔板）表面，通過酶標(biāo)記的抗原或抗體與待測樣品中的目標(biāo)蛋白結(jié)合，加入底物后酶催化顯色反應(yīng)，通過吸光度值定量分析目標(biāo)蛋白。

類型

1. 直接法：標(biāo)記抗體直接結(jié)合抗原。

2. 間接法：用未標(biāo)記的一抗結(jié)合抗原，再用酶標(biāo)記的二抗檢測一抗。

3. 夾心法：用捕獲抗體固定抗原，再用酶標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合抗原，適用于雙表位抗原的定量。

4. 競爭法：待測抗原與標(biāo)記抗原競爭結(jié)合抗體，用于小分子抗原檢測。

應(yīng)用

• 醫(yī)學(xué)診斷：檢測病原體抗體（如 HIV、乙肝病毒）、腫瘤標(biāo)志物（如 CEA）。

• 科研：細(xì)胞因子、激素等微量蛋白的定量分析。

點(diǎn)

靈敏度高（pg-ng 級）、操作簡便、可高通量檢測。

缺點(diǎn)

可能存在非特異性結(jié)合，需設(shè)置嚴(yán)格對照；僅能檢測可溶性蛋白。

二、免疫印跡法（Western Blot，WB）

原理

1. 電泳分離：通過 SDS-PAGE 電泳按分子量分離蛋白樣品。

2. 轉(zhuǎn)膜：將蛋白轉(zhuǎn)移到固相膜（如 PVDF 膜、硝酸纖維素膜）上。

3. 免疫反應(yīng)：用一抗和酶 / 熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合目標(biāo)蛋白，通過化學(xué)發(fā)光或顯色劑顯影。

   
   

應(yīng)用

• 驗證蛋白表達(dá)（定性或半定量），分析蛋白分子量及修飾（如磷酸化、糖基化）。

• 檢測細(xì)胞或組織中的特異性蛋白（如癌癥相關(guān)蛋白）。

  
  

優(yōu)點(diǎn)

缺點(diǎn)

操作步驟繁瑣，耗時較長；定量準(zhǔn)確性低于 ELISA。

三、免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence，IF）

原理

用熒光素（如 FITC、Alexa Fluor）標(biāo)記抗體，與細(xì)胞或組織中的目標(biāo)蛋白結(jié)合，通過熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察熒光信號，定位蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布（如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核）。

類型

• 直接免疫熒光：標(biāo)記一抗直接結(jié)合抗原。

• 間接免疫熒光：未標(biāo)記一抗結(jié)合抗原，再用熒光標(biāo)記的二抗檢測，信號更放大。

  
  

應(yīng)用

• 細(xì)胞生物學(xué)：研究蛋白亞細(xì)胞定位、動態(tài)變化（如細(xì)胞骨架蛋白、受體分布）。

• 自身抗體檢測：如抗核抗體（ANA）的熒光顯微鏡診斷。

  
  

優(yōu)點(diǎn)

直觀顯示蛋白空間分布，可實現(xiàn)多色標(biāo)記（同時檢測多種蛋白）。

缺點(diǎn)

需熒光顯微鏡，樣品制備要求高；熒光信號可能隨時間衰減。

四、免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunohistochemistry，IHC）

原理

將組織樣本制成切片（如石蠟切片、冰凍切片），用抗體檢測組織中目標(biāo)蛋白的定位和表達(dá)水平，通過酶顯色（如 DAB 顯色呈棕黃色）或熒光標(biāo)記顯示結(jié)果。

應(yīng)用

• 病理診斷：鑒別腫瘤類型（如乳腺癌 ER/PR 檢測）、判斷預(yù)后（如 Ki-67 增殖指數(shù)）。

• 研究組織中蛋白的分布特征（如炎癥因子在組織中的表達(dá)）。

  
  

優(yōu)點(diǎn)

保留組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，便于結(jié)合病理特征分析。

缺點(diǎn)

結(jié)果判讀依賴經(jīng)驗，定量準(zhǔn)確性較低。

五、免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）

原理

應(yīng)用

• 研究蛋白 - 蛋白相互作用（如免疫共沉淀 Co-IP）。

• 富集低豐度蛋白，用于結(jié)構(gòu)或功能研究。

優(yōu)點(diǎn)

缺點(diǎn)

需高親和力抗體，操作需優(yōu)化避免非特異性結(jié)合。

六、流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）

原理

應(yīng)用

• 免疫學(xué)：免疫細(xì)胞分型（如 T 細(xì)胞亞群 CD4+/CD8 + 檢測）。

• 癌癥研究：細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白分析。

優(yōu)點(diǎn)

缺點(diǎn)

需流式細(xì)胞儀，樣品需制備成單細(xì)胞懸液。

七、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）

原理

應(yīng)用

臨床檢測：激素（如甲狀腺激素）、腫瘤標(biāo)志物的高靈敏度定量。

優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高于 ELISA（fg 級），自動化程度高，適合大規(guī)模檢測。

技術(shù)發(fā)展趨勢

1. 多重檢測：如流式細(xì)胞術(shù)、多色免疫熒光可同時檢測多種蛋白。

2. 自動化與高通量：ELISA、CLIA 的全自動檢測平臺提高效率。

3. 高分辨率成像：超分辨率顯微鏡結(jié)合免疫熒光技術(shù)，解析蛋白納米級分布。

4. 單細(xì)胞技術(shù)：單細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)實現(xiàn)單細(xì)胞水平異質(zhì)性分析。

這些技術(shù)各有側(cè)重，實際應(yīng)用中需根據(jù)檢測目的（定性 / 定量 / 定位）、樣品類型（細(xì)胞 / 組織 / 體液）及靈敏度要求選擇合適的方法，或結(jié)合多種技術(shù)進(jìn)行綜合分析。

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